在各种基因治疗疗法中，如何操纵和编辑基因是其中的关键步骤，介绍几种最常用的改变基因的结构和功能的技术。

1. CRISPR‐Cas9：一种可以定点修改DNA序列的基因组编辑技术，可以用于编辑、插入或删除基因，被广泛应用于生命科学研究和基因治疗等领域。1987年，日本科学家石野良纯在细菌DNA中偶然发现的一种重复DNA结构，即CRISPR（规律间隔成簇短回文重复序列），但这些DNA重复序列的作用一直未被发现。CRISPR-Cas9被用于基因组内基因编辑，成为了基因治疗非常有用和理想的工具。CRISPR-Cas9介导的基因治疗的主要组成部分是单导RNA（sgRNA），它具有一个导向序列，以定位需要修复的目标基因，并且它具有的一个框架序列可以将其固定到Cas9酶上。使用CRISPR-Cas9进行基因治疗有两种方法，第一种是通过同源重组修复（HDR）机制修复受损基因，在这个系统中，受损的靶基因通过替换为完整和健康的同源基因来进行修正；第二种是利用非同源末端连接（NHEJ）会导致DNA片段随机插入到基因序列中，从而改变基因功能或完全沉默基因的方法，用于治疗需要删除或沉默基因的遗传疾病。CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用存在一些限制，主要体现在以下几个方面：（1）脱靶效应：脱靶效应的发生率很高，在作用于目标基因时，有时也会不可避免地影响到非目标基因，导致基因组中的其他区域产生潜在的、不可预测的变化，其发生频率超过50％。（2）需要原始空间序列相邻区域基序（PAM）。（3）DNA损伤毒性：编辑或敲除目标基因的第一步是通过Cas9创建切口，这往往会导致细胞凋亡并可能损伤目标组织。

2. 锌指核酸酶。锌指核酸酶是一种通过将DNA切割域和锌指融合在一起制成的限制性酶。首先，将锌指结合域改造成能够特异性结合目标基因序列。该酶会在目标序列内引发双链断裂，宿主细胞的修复机制会继续修复受损基因，技术较为老旧，但已用于治疗各种疾病。通过改造锌指结合域以实现特异性结合目标基因序列，可以用于治疗各种疾病，通过腺病毒载体将编码基因传递到组织中，通过宿主细胞的修复机制修复受损基因，从而达到治疗疾病的效果。

3. 转录激活因子样效应物核酸酶：其DNA结合域是由黄单胞菌分泌的转录激活因子样效应物核酸酶组成。这些结合域是细菌的防御机制，用于抑制宿主细胞的免疫反应，最具优势的特点是可以简单地工程化它们的DNA识别位点，从而靶向所需的基因。